作為科研生產中較重要的基礎性資源—菌毒種,其收集、保藏及相關的研究工作在我國正處于整理、整合以及全方面逐步正規化階段.2003年7月23日,科技部在北京召開了“國家科技基礎條件平臺建設”部際聯席會和專家顧問組成立大會,正式啟動了國家科技基礎條件平臺建設工作.國家自然科技資源共享平臺建設作為其中的一個重要組成部分同步啟動.作為該項8的一個重要組成部分,微生物菌種資源整理、整合工作同期啟動,在此項工作中,中國獸醫藥品監察所承擔了獸醫微生物資源整理、整合工作.本所在行業內發展了數家加盟單位,在整理、整合菌種資源的過程中遇到了一些實驗室細菌鑒定結果出現偏差的問題.經分析調查,多是由于實驗室人員結構以及實驗室的硬件水平差別較大等原因,造成實驗室間鑒定能力的參差不齊,致使鑒定項目完成情況不盡相同,細菌鑒定結果出現偏差。
細菌鑒定是指將分離培養獲得的病原菌,通過純化培養使其達到不含有其他微生物的純培養程度,繼而進行系統鑒定.而菌種保藏機構在收集一些已經凍干的菌種時,應在開啟后經過兩代的適應性培養方可進行復核性的系統鑒定.系統鑒定是通過細菌的形態結構、生長特性、抗原性、病原性以及目前流行的核酸測定方法等檢測,并用已知標準免疫血清確定分離細菌的屬、種和型(群).目前菌種保藏機構通常使用的細菌鑒定方法大致有以下幾種：
傳統方法
常規宏觀菌落形態學觀察,主要觀察菌落在其適合的培養基上的生長狀況:細菌在固體培養基上的生長形態、大小、顏色是否均勻一致,菌落個體表面及邊緣的生長狀況;在液體培養基上的渾濁狀況、沉淀狀況、液面菌膜狀況;半固體上穿刺接種后,觀察細菌是否沿著接種線生長以及其生長狀態是呈毛刷樣生長還是均勻生長,上下生長是否一致.在鑒別培養基上培養,觀察結果是否跟預期結果相同。
細菌的個體形態學觀察,即通過顯微鏡觀察.觀察前細菌需要著色,要根據預先確定的觀察項目選擇與之相對應的染色方法,目前常用的染色方法包括革蘭氏染色法、美藍染色法、Ziehl—Neelsen染色法、姬姆薩染色法、鞭毛染色法、芽胞染色法等.盡量挑選對數生長期的細菌進行染色觀察,此時的細菌生長處于幼期,利于觀察,因為一些陳舊細菌的染色結果會有變化,如本為革蘭氏陽性菌經過長期擱置后染色結果可能為革蘭氏陰性.同時細菌培養時要注意培養基的挑選,一些細菌的特殊結構如莢膜、鞭毛、菌毛、芽胞等,其表達是需要在特定的培養基上才能正常發育,有的細菌如炭疽在一般的培養基上不形成莢膜,只在動物體內形成明顯的莢膜,所以需先接種實驗動物后用病料進行涂片鏡檢.在鏡檢時觀察細菌基本形態結構和大小及其排列狀態、菌端形狀、有無兩極染色、有無形成芽胞和莢胞等。
形態學鑒定輔以生化試驗在細菌鑒定中具有重要的意義,生化試驗是根據細菌培養過程中不同菌種所產生的新陳代謝產物各異,表現出不同的生長特性.通過生物化學的方法來檢測這些物質的存在與否,從而能夠得到細菌的鑒定結果.如糖(醇)類代謝試驗、氨基酸和蛋白質代謝試驗、有機酸鹽和胺鹽利用試驗、呼吸酶類試驗、毒性酶類試驗等
血清型鑒定是根據細菌具有相對特異性的抗原結構這個特點進行微生物鑒定的特異方法.抗原的特異性程度又存在于屬間細菌所共有的共同抗原,這種抗原的存在,能表明其屬性.另一類特異性抗原只存在于特定的種、型,是確定細菌種、型的重要依據.通過專門的分型血清即可對這些細菌的血清型進行鑒定。
細菌毒力的測定,病原菌侵入機體能否引起疾病與其本身的毒力、侵入機體的數量和侵入部位有關.不同的病原菌或同種細菌不同的型或株,毒力常不一致.常用LD50或ID50表示毒力,即在一定時間內,能使一定條件的某種動物半數死亡或感染需要的較小細菌數或毒素量.毒力測定在菌種鑒定過程中可用于鑒別一些有代表性的菌株.LD50可用Reed—Muench公式進行計算。
儀器自動化鑒定
隨著儀器分析技術的進步和計算機的廣泛應用,微生物菌種鑒定逐漸由傳統的形態學觀察和人工生理生化實驗鑒定發展進入了基于儀器自動化分析的鑒定系統階段.近20年來,一系列商品化自動鑒定系統相繼推出,并在應用中取得理想效果,如VITEK系統、MIDl系統、BIOLOG系統、 SENSITl．TRE系統、AUTOSCEPTOR系統以及MICROSCAN系統等.下面以BIOLOG微生物鑒定系統為例,簡述微生物自動鑒定系統的工作原理:BIOLOG微生物自動分析系統是美國Biolog公司從1989年開始推出的一套微生物鑒定系統,該系統主要根據細菌對糖、醇、酸、醋、胺和大分子聚合物等95種碳源的利用情況進行鑒定.細菌利用碳源進行呼吸時,會將四哇類氧化還原染色劑(TV)從無色還原成紫色,從而在鑒定微平板(96孔板)上形成該菌株特征性的反應模式或“指紋圖譜”,通過纖維光學讀取設備——讀數儀來讀取顏色變化(分為“自動”和“人工”兩種讀取方式),由計算機通過概率較大模擬法將該反應模式或“指紋圖譜”與數據庫相比較,可以在瞬間得到鑒定結果,確定所分析的菌株的屬名或種名.以BIOLOG系統6．01版數據庫為例,包含了革蘭氏陰性好氧菌524種、革蘭氏陽性好氣菌341種、厭氧菌361種、酵母菌267種、絲狀真菌(含部分酵母菌)619種以及幾種特殊的致病菌,目前這個數據庫已進行更新.利用微生物快速系統進行細菌鑒定,能節省時間,但由于其在數據比對過程中記入一些非特異性的陽性反應孔,會造成偶然誤差,從而引起個別鑒定結果不穩定,另外此類儀器本身及其耗材價格均較高。
分子生物學鑒定
分子生物學鑒定目前比較流行的主要是核酸檢測技術,包括基因測序、指紋圖譜技術、基因探針技術、聚合酶鏈反應(PCR)、GC含量測定等.PCR和核酸雜交單獨或結合在儀器已經形成比較經典的核酸檢測技術,目前這兩者已經得到了較大范圍的推廣和應用。
下面將簡單介紹幾種核酸檢測技術的原理：
DNA的G+C含量測定法
此法是根據細菌的DNA中G+C含量的特異性來進行細菌鑒定,通過熔解溫度(Tm)法或浮力密度法測定細菌DNA中G+C的含量,通過對比來鑒定細菌。
擴增片段長度多態性(AFLP)分析
此法是一種測定基因組限制性片段的DNA指紋技術,通過PCR選擇性地擴增整個基因組DNA的內切酶片段,在分辨率高的聚丙烯酰氨凝膠上電泳,產生一組特異的DNA限制性片段的指紋圖譜.與其他DNA指紋技術相比有其獨特的優點:可用于各種大小不同的基因組的指紋分析,為研究細菌屬乃至株間的親緣關系提供一個有效手段;具有一定的靈活性,可通過特異性PCR引物的設計和內切酶組合的選擇,調整AFLP圖譜中限制性片段的適宜數目;由于適用了嚴格的PCR條件和高分辨率的聚丙烯酰氨凝膠電泳,因而重復性好,分辨率高;AFLP不僅僅是簡單的指紋技術,而且可作為連接遺傳圖譜與物理圖譜間的橋梁而用于基因組的研究。
限制性片段長度多態性(RFLP)分析
其原理是用限制性內切酶將細菌基因組DNA進行切割,之后在瓊脂糖凝膠上電泳分離,以顯示不同種群基因組DNA的限制性片段長度多態性.RFLP產生的指紋圖譜更適用于細菌種間及種內株間的分型鑒定。
隨機擴增DNA多態性(RAPD)分析,又稱為隨意引物PCR(AP—
它是一種DNA指紋多態性分析技術,其理論依據是不同的基因組中與隨意引物匹配的堿基序列的位點和數目可能不同,因而用一組人為設計的核苷酸作為引物,通過PCR隨機擴增可產生物種特異性的DNA帶譜。
16S rRNA鑒定
細菌的核糖體RNA(rRNA)基因高度保守且進化速度緩慢,在漫長的進化過程中保留了rRNA基因結構和功能的同源性,在微生物染色體上可存在多個拷貝,以rRNA基因片段為探針可檢出含有rRNA基因的DNA片段.分析雜交后得到的rRNA指紋圖,為菌種定型和近緣菌株的鑒定提供了一種新技術.針對rRNA基因的核糖體分型可成功地區分多個菌種的相關菌株,因此該技術也被廣泛稱作核糖體分型技術.原核生物含有23S、16S和5S三種 rRNA,其大小分別約為3000、1500和120個堿基.其中作為小亞單位核糖體RNA的16S rRNA的大小較適合于核糖體分型.一般完成l6S rRNA序列測定后,在GenBank中與已知的序列進行BLAST分析,從而得出鑒定結果。
小結
一般來說,對于微生物的檢測或鑒定應當至少使用三種指標同時進行驗證.傳統的分類鑒定需要測定的項目眾多,工作程序繁瑣,耗時長.在某些時候可以配合分子生物學的方法進行鑒定,如在進行菌株的血清型鑒定時,對于某些國內資源稀缺的菌株定型血清,而進口定型血清價格昂貴,國內可以開發分子生物學分型方法完成菌株的血清分型工作.而在利用分子生物學方法鑒定菌株血清型時,經常會遇到有一些菌株的血清型種類繁多,目前還無法通過簡單的核酸測定完成血清定型工作,如大腸桿菌,僅O抗原就有上百種血清型,對于這種情況在使用血清進行定型的同時,還需要繼續深入研究其分型技術.目前市場上的微生物自動鑒定系統雖然基本上都通過了相關權威組織的認可,在細菌快速鑒定或初步鑒定中起到了一定的作用,但如前所述,其穩定性尚存在一定問題,同樣需要配合其他方法來相互印證,從而完成細菌鑒定工作。
